分析原理

 

在生物流體和血清中的許多復合物和蛋白本身就可以發(fā)熒光，因此使用傳統(tǒng)的發(fā)色團進而進行熒光檢測的靈敏度就會嚴重下降。大部分背景熒光信號是短時存在的，因此將長衰減壽命的標記物與時間分辨熒光技術(shù)相結(jié)合，就可以使瞬時熒光干擾減到zui小化。

 

時間分辨熒光分析法（TRFIA）實際上是在熒光分析（FIA）的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，它是一種特殊的熒光分析。熒光分析利用了熒光的波長與其激發(fā)波長的巨大差異克服了普通紫外-可見分光分析法中雜色光的影響，同時，熒光分析與普通分光不同，光電接受器與激發(fā)光不在同一直線上，激發(fā)光不能直接到達光電接受器，從而大幅度地提高了光學分析的靈敏度。但是，當進行超微量分析的時候，激發(fā)光的雜散光的影響就顯得嚴重了。因此，解決激發(fā)光的雜散光的影響成了提高靈敏度的瓶頸。

 

解決雜散光影響的方法當然是測量時沒有激發(fā)光的存在。但普通的熒光標志物熒光壽命非常短，激發(fā)光消失，熒光也消失。不過有非常少的稀土金屬（Eu、Tb、Sm、Dy）的熒光壽命較長，可達1～2ms，能夠滿足測量要求，因此而產(chǎn)生了時間分辨熒光分析法，即使用長效熒光標記物，在關(guān)閉激發(fā)光后再測定熒光強度的分析方法。

平時常用的稀土金屬主要是Eu（銪）和Tb（鋱），Eu熒光壽命1ms，在水中不穩(wěn)定，但加入增強劑后可以克服；Tb熒光壽命1.6ms，水中穩(wěn)定，但其熒光波長短、散射嚴重、能量大易使組分分解，因此從測量方法學上看Tb很好，但不適合用于生物分析，故Euzui為常用。

 

信號原理

 

普通物質(zhì)熒光光譜分為激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，在選擇熒光物質(zhì)作為標記物時，必須考慮激發(fā)光譜和發(fā)射光譜之間的波長差，即Stokes位移的大小。如果Stokes位移小，激發(fā)光譜和發(fā)射光譜常有重疊，相互干擾，影響檢測結(jié)果的準確性。鑭系元素的熒光光譜有較大的Stokes位移，zui大可達290nm，激發(fā)光譜和發(fā)射光譜間不會相互重疊，加上其發(fā)射的光譜信號峰很窄，熒光壽命長，銪的熒光壽命可達730us，檢測中只要在每個激發(fā)光脈沖過后采用延緩測量時間的方式，待短壽命的背景熒光衰變消失后，再打開取樣門儀器記錄長壽命銪鰲合物發(fā)射的特異性熒光，可以避免本底熒光干擾，提高檢測的精密度。

 

TRFIA的測量儀器是時間分辨熒光計，由三大部分組成：光源：脈沖光源：氙燈（每秒閃爍1000次）；小型N2激光器；輸出脈沖波長：337nm熒光信號獲取系統(tǒng)；數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)醫(yī)學教|育網(wǎng)搜集整理。

 

增強原理

 

解離增強鑭系元素熒光免疫分析（DELFIA）是時間分辨熒光免疫分析中的一種。它用具有雙功能基團結(jié)構(gòu)的螯合劑，使其一端與銪（Eu）連接，另一端與抗體/抗原分子上的自由氨基連接，形成EU標記的抗體/抗原，經(jīng)過免疫反應(yīng)之后生成免疫復合物。由于這種復合物在水中的熒光強度非常弱，因此加入一種增強劑，使Eu從復合物上解離下來，自由Eu同增強劑中的另一種螫合劑螯合形成一種膠態(tài)分子團，這種分子團在紫外光的激發(fā)下能發(fā)出很強的熒光，信號增強了百萬倍。因為這種分析方法使用了解離增強步驟，因此稱為解離增強鑭系元素熒光免疫分析。這是目前在時間分辨熒光免疫分析中應(yīng)用zui多的一種分析系統(tǒng)。