免疫熒光是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素制成熒光標(biāo)記物，再用這種熒光抗體（或抗原）作為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。在細(xì)胞或組織中形成的抗原抗體復(fù)合物上含有熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，免疫熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光（黃綠色或桔紅色），可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測定含量。
免疫熒光實驗的主要步驟包括細(xì)胞片制備、固定及通透（或稱為透化）、封閉、抗體孵育及熒光檢測等。細(xì)胞片制備（通俗的說法是細(xì)胞爬片）是免疫熒光實驗的步，細(xì)胞片的質(zhì)量對實驗的成敗至關(guān)重要，原因很簡單，如果發(fā)生細(xì)胞掉片，一切都無從談起。這一步關(guān)鍵的是玻片的處理以及細(xì)胞的活力，有人根據(jù)成功經(jīng)驗總結(jié)出許多有益的細(xì)節(jié)或小竅門，非常值得借鑒。固定和通透步驟重要的是根據(jù)所研究抗原的性質(zhì)選擇適當(dāng)?shù)墓潭ǚ椒?，合適的固定劑和固定程序?qū)τ讷@得好的實驗結(jié)果是非常重要的。
免疫熒光中的封閉和抗體孵育與其他方法（如ELISA或Western Blot）中的相同步驟是類似的，重要的區(qū)別在于免疫熒光實驗中要用到熒光抗體，因此必須謹(jǐn)記避光操作，此外，抗體濃度的選擇可能更加關(guān)鍵。后需要注意的是，標(biāo)記好熒光的細(xì)胞片應(yīng)盡早觀察，或者用封片劑封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因標(biāo)記蛋白解離或熒光減弱而影響實驗結(jié)果。
