原位雜交組織（或細(xì)胞）化學(xué)（InsituHybridizationHistochemistry，ISHH）簡(jiǎn)稱原位雜交（InSituHybridization），屬于固相分子雜交的范疇，它是用標(biāo)記的DNA或RNA為探針，在原位檢測(cè)組織細(xì)胞內(nèi)特定核酸序列的方法。根據(jù)所用探針和靶核酸的不同，原位雜交可分為DNA-DNA雜交，DNA-RNA雜交和RNA-RNA雜交三類。
　　
　　根據(jù)探針的標(biāo)記物是否直接被檢測(cè)，原位雜交又可分為直接法和間接法兩類。直接法主要用放射性同位素、熒光及某些酶標(biāo)記的探針與靶核酸進(jìn)行雜交，雜交后分別通過放射自顯影、熒光顯微鏡術(shù)或成色酶促反應(yīng)直接顯示。間接法一般用半抗原標(biāo)記探針，zui后通過免疫組織化學(xué)法對(duì)半抗原定位，間接地顯示探針與靶核酸形成的雜交體。
　　
　　原位雜交zui初是以同位素標(biāo)記探針進(jìn)行的。盡管同位素標(biāo)記（如35S，3H，32P等）仍然廣泛使用，但非同位素標(biāo)記探針的迅速發(fā)展（尤其是生物素標(biāo)記探針和地高辛標(biāo)記探針），更引起科技工作者的極大興趣。
　　
　　一、基本要求
　　
　　1.組織取材：組織取材應(yīng)盡可能新鮮。由于組織RNA降解較快，所以新鮮組織和培養(yǎng)細(xì)胞在30min內(nèi)固定。
　　
　　2.固定目的是：
　　
　?。?）保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)；
　　
　?。?）zui大限度地保持細(xì)胞內(nèi)DNA或RNA的水平；
　　
　　（3）使探針易于進(jìn)入細(xì)胞或組織。
　　
　　zui常用的固定劑是多聚甲醛，與其它醛類固定劑（如戊二醛）不同，多聚甲醛不會(huì)與蛋白質(zhì)產(chǎn)生廣泛的交叉連接，因而不會(huì)影響探針穿透入細(xì)胞或組織。
　　
　　3.增強(qiáng)組織的通透性和核酸探針的穿透性：
　　
　?。?）稀酸處理和酸酐處理：為防止探針與組織中堿性蛋白之間的靜電結(jié)合，以降低背景，雜交前標(biāo)本可用0.25%乙酸酐處理10min，經(jīng)乙酸酐處理后，組織蛋白中的堿性基團(tuán)通過乙?；蛔钄唷＝M織和細(xì)胞標(biāo)本亦可用0.2MHCl處理10min，稀酸能使堿性蛋白變性，結(jié)合蛋白酶消化，容易將堿性蛋白移除。
　　
　?。?）去污劑處理：去污劑處理的目的是增加組織的通透性，利于雜交探針進(jìn)入組織細(xì)胞，zui常應(yīng)用的去污劑是TritonX-100。注意：過度的去污劑處理不僅影響組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)，而且還會(huì)引起靶核酸的丟失。
　　
　?。?）蛋白酶處理：蛋白酶消化能使經(jīng)固定后被遮蔽的靶核酸暴露，以增加探針對(duì)靶核酸的可及性。常用的蛋白酶有蛋白酶K（proteinaseK），還有鏈霉蛋白酶（pronase）和胃蛋白酶（pepsin）等。
　　
　　4.雜交緩沖液孵育：
　　
　　雜交前用不含探針的雜交緩沖液在雜交溫度下孵育2hr，以阻斷玻片和標(biāo)本中可能與探針產(chǎn)生非特異性結(jié)合的位點(diǎn)，達(dá)到減低背景的目的。
　　
　　5.防止污染：
　　
　　由于在手指皮膚及實(shí)驗(yàn)室用玻璃器皿上均可能含有RNA酶，為防止其污染影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在整個(gè)雜交前處理過程中都需要戴消毒手套，實(shí)驗(yàn)所用玻璃器皿及鑷子都應(yīng)于實(shí)驗(yàn)前一日置高溫烘烤（180℃）以達(dá)到消除RNA酶的目的。雜交前及雜交時(shí)所用的溶液均需經(jīng)高壓消毒處理。
　　
　　6.雙鏈DNA探針和靶DNA的變性：
　　
　　雜交反應(yīng)進(jìn)行時(shí)，探針和靶核酸都必須是單鏈的。如果用雙鏈DNA探針進(jìn)行雜交（包括檢測(cè)RNA時(shí)），雙鏈DNA探針在雜交前必須進(jìn)行變性。探針變性后要立即進(jìn)行雜交反應(yīng)，不然解鏈的探針又會(huì)重新復(fù)性。
　　
　　雜交液：
　　
　　雜交液內(nèi)除含一定濃度的標(biāo)記探針外，還含有較高濃度的鹽類、甲酰胺、硫酸葡聚糖、牛血清白蛋白及載體DNA或RNA等。
　　
　　雜交液中含有較高濃度的Na+可使雜交率增加，可以減低探針與組織標(biāo)本之間的靜電結(jié)合。甲酰胺可使Tm降低，雜交液中含每1%的甲酰胺可分別使RNA：RNA，RNA：DNA，DNA：DNA的雜交溫度降低0.35℃，0.5℃和0.65℃。
　　
　　所以，雜交液中加入適量的甲酰胺，可避免因雜交溫度過高而引起的組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的破壞以及標(biāo)本的脫落。硫酸葡聚糖能與水結(jié)合，從而減少雜交液的有效容積，提高探針有效濃度，以達(dá)到提高雜交率的目的（尤其對(duì)雙鏈核酸探針）。
　　
　　在雜交液中加入牛血清白蛋白及載體DNA或RNA等，都是為了阻斷探針與組織結(jié)構(gòu)成分之間的非特異性結(jié)合，以減低背景。
　　
　　探針的濃度：
　　
　　探針濃度依其種類和實(shí)驗(yàn)要求略有不同，一般為0.5~5.0μg/ml（0.5~5.0ng/μl）。zui適宜的探針濃度要通過實(shí)驗(yàn)才能確定。
　　
　　探針的長(zhǎng)度：
　　
　　一般應(yīng)在50-300個(gè)堿基之間，zui長(zhǎng)不宜超過400個(gè)堿基。探針短易進(jìn)入細(xì)胞，雜交率高，雜交時(shí)間短。