免疫熒光技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素，制成熒光抗體，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢測組織或細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。在組織或細(xì)胞內(nèi)形成的抗原抗體復(fù)合物上含有標(biāo)記的熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，熒光素受外來激發(fā)光的照射而發(fā)生明亮的熒光（黃綠色或橘紅色），可以看見熒光所在的組織細(xì)胞，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測定含量。

　　

　　很多新手在著手免疫熒光實(shí)驗(yàn)時(shí)會(huì)遇到各種各樣的問題，從而不能得到理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。下面小編為大家總計(jì)了幾點(diǎn)試驗(yàn)需要注意的方面：

　　

　　1.合適的細(xì)胞密度

　　

　　首先細(xì)胞密度是試驗(yàn)成功的前提，細(xì)胞密度太大，會(huì)造成細(xì)胞過于擁擠而邊界不清晰，不僅細(xì)胞形態(tài)不佳且易導(dǎo)致染色背景深。同理細(xì)胞過少時(shí)不僅容易貼壁不好觀察時(shí)不好找細(xì)胞，而且由于細(xì)胞過少可能活性不佳從而易發(fā)生非特異性熒光染色。不管是用六孔板還是共聚焦皿細(xì)胞密度以達(dá)到75%-85%為佳。

　　

　　2.細(xì)胞固定和通透

　　

　　固定劑的選擇依賴于抗原的亞細(xì)胞定位（膜蛋白，可溶，細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白等）。3.7%-4%的甲醛或多聚甲醛是常用的固定劑，適用于絕大多數(shù)蛋白。如果是研究膜蛋白的話，用3.7%-4%的甲醛。而研究細(xì)胞骨架成分可用甲醇固定法。固定后一般需要通透步驟，通透即是在膜上打孔，讓抗體更易進(jìn)入細(xì)胞與抗原結(jié)合。選擇通透劑應(yīng)充分考慮抗原蛋白的性質(zhì)。通透一般可以用0.1%-0.2%的Triton-X100，而選擇甲醇固定一般無需再通透，甲醇本身就有通透的作用。

　　

　　3.封閉條件的優(yōu)化選擇

　　

　　為了防止內(nèi)源性非特異性蛋白抗原的結(jié)合，需要在一抗孵育前用封閉液封閉，這樣可以減少非特異性的背景著色。封閉液可以選擇二抗來源一致的血清，一般來說，血清價(jià)格比較昂貴，可以用1%-5%BSA替代，BSA可以說是萬能的封閉血清。另外封閉時(shí)間不易過長，30-60min即可，且封閉后不用洗滌，直接加一抗孵育即可。

　　

　　4.一抗二抗的選擇

　　

　　封閉過后需要一抗孵育，可以選擇4度過夜孵育或者室溫3h，以筆者的經(jīng)驗(yàn)是一抗孵育4度過夜比較好，抗原抗體結(jié)合會(huì)比較充分。一抗二抗的稀釋比例可以根據(jù)抗體說明書來，再根據(jù)自己具體的實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行優(yōu)化。如果抗體濃度過低，會(huì)造成信號太弱，如果抗體濃度過高可能會(huì)造成背景染色太強(qiáng)。熒光二抗個(gè)人感覺Alexflour熒光基團(tuán)信號強(qiáng)于Dylight強(qiáng)于FITC。如果做免疫雙標(biāo)，一抗要來自不同種屬，熒光二抗的光譜也要分開。

　　

　　5.洗滌步驟

　　

　　免疫熒光過程中，有很多洗滌步驟，用PBS即可。在洗滌過程中，一要注意動(dòng)作輕柔，固定后的細(xì)胞比較脆弱，如果太過大力，很容易把細(xì)胞吹洗掉，二是洗滌時(shí)間要把握好，每次洗滌5min左右，三是切忌不要干片，即吸掉溶液后不要把細(xì)胞干著，不然容易造成背景著色。