熒光定量PCR是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，zui后通過標準曲線對初始模板進行定量分析的方法。它的出現(xiàn)解決了傳統(tǒng)PCR不能對初始模板定量分析的問題。具有準確性高、靈敏度高、特異性強等優(yōu)點，目前已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域。

　　

　　熒光定量PCR結(jié)果分析：

　　

　　一般而言，熒光擴增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段、熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化；在平臺期，擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級增加，PCR終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，無法計算起始模板拷貝數(shù)。因此只有在熒光信號指數(shù)擴增階段，PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，故選擇在這個階段進行定量分析。為了定量方便，在熒光定量PCR技術(shù)中引入了幾個重要的概念：擴增曲線、熒光閾值、CT值。

　　

　　注：

　　

　　橫坐標：代表擴增循環(huán)數(shù);

　　

　　縱坐標：代表熒光強度，每個循環(huán)進行一次熒光信號收集。

　　

　　(2)熒光閾值(Threshold)

　　

　　在熒光擴增曲線上人為設(shè)定的一個值，它可以設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴增階段任意位置上，但一般熒光閾值的設(shè)置是PCR反應(yīng)前3-15個循環(huán)熒光信號標準偏差的10倍。

　　

　　(3)CT值

　　

　　每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標代表Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。同時，對于熒光PCR實驗來說，CT值也是判讀樣品陰陽性的重要指標。