免疫熒光技術(shù)又稱熒光抗體技術(shù)，是標記免疫技術(shù)中發(fā)展早的一種。它是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項技術(shù)。很早以來就有一些學者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原抗體反應進行組織或細胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。它是根據(jù)抗原抗體反應的原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光基團，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢查細胞或組織內(nèi)的相應抗原（或抗體）。利用熒光顯微鏡可以看見熒光所在的細胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)和定位。

　　

　　一、免疫熒光技術(shù)基本實驗步驟：

　　

　　1、細胞準備。對單層生長細胞，在傳代培養(yǎng)時，將細胞接種到預先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待細胞接近長成單層后取出蓋玻片，PBS洗兩次；對懸浮生長細胞，取對數(shù)生長細胞，用PBS離心洗滌（1000rpm,5min）2次，用細胞離心甩片機制備細胞片或直接制備細胞涂片。

　　

　　2、固定。根據(jù)需要選擇適當?shù)墓潭▌┕潭毎９潭ㄍ戤吅蟮募毎芍糜诤B氮納的PBS中4℃保存3個月。

　　

　　3、通透。使用交聯(lián)劑（如多聚甲醛）固定后的細胞，一般需要在加入抗體孵育前，對細胞進行通透處理，以保證抗體能夠到達抗原部位。選擇通透劑應充分考慮抗原蛋白的性質(zhì)。

　　

　　4、封閉。使用封閉液對細胞進行封閉，時間一般為30min。

　　

　　5、一抗結(jié)合。室溫孵育1h或者4℃過夜，PBST漂洗3次，每次沖洗5min。

　　

　　6、二抗結(jié)合。間接免疫熒光需要使用二抗，室溫避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次沖洗5min后，再用蒸餾水漂洗一次。

　　

　　7、封片及檢測。滴加封片劑一滴，封片，熒光顯微鏡檢查。

　　

　　二、免疫熒光技術(shù)注意事項：

　　

　　1、染完之后沒有封片前直接照一些，因為有的時候可能封片會出現(xiàn)問題，再想照反而沒有了，另外不要拖太長時間，熒光會崔滅的。

　　

　　2、熒光的片子一定要避光保存，保存的好的話，過一段時間仍然能照出很好的片子。

　　

　　3、二抗用之前一定離心，不然有的時候有那種沉淀，在片子上就是一個很大的非特異性熒光光點，非常難看。

　　

　　4、整個操作在4℃下進行，洗滌液中加有比常規(guī)防腐劑量高10倍的NaN３，上述實驗條件是防止一抗結(jié)合細胞膜抗原后發(fā)生交聯(lián)、脫落。

　　

　　5、洗滌要充分，以避免游離抗體封閉二抗與細胞膜上一抗相結(jié)合，出現(xiàn)假陰性。

　　

　　6、加適量正常兔血清可封閉某些細胞表面免疫球蛋白Fc受體，降低和防止非特異性染色。

　　

　　7、細胞活性要好，否則易發(fā)生非特異性熒光染色?？勾銣鐒┛赡脕碇苯臃馄?20微升即可，之后片子可保留更長時間。