腫瘤細胞對化療藥物產生耐藥性是腫瘤治療失敗的重要因素之一，成為目前阻礙腫瘤治療的絆腳石。因此，探索腫瘤細胞產生耐藥的原因以及如何改善腫瘤細胞對化療藥物耐藥仍是目前研究的熱點和難點。腫瘤細胞耐藥的產生是一個復雜的過程，它的機制廣泛牽涉到藥物代謝學、病理學、生理學等多個學科，這就決定了腫瘤細胞對化療藥物產生耐藥的機制是復雜的，因此體外建立化療藥物耐藥細胞株仍然是研究腫瘤細胞耐藥機制的重要方法。

　　

　　一種藥物長期作用于某類細胞，殺死其中沒有抗性的細胞，而對這類細胞中具有抗性的細胞不能殺死，即進行了選擇。具有抗性的細胞大量繁殖產生很多抗性后代，但再用這種藥物時表現(xiàn)出的藥效大大下降的現(xiàn)象就是細胞的耐藥性，采用體外低濃度梯度遞增聯(lián)合大劑量間斷沖擊方法誘導腫瘤細胞對特定藥物產生耐藥性，從而構建出對特定藥物產生耐藥性的腫瘤細胞株。

　　

　　耐藥細胞株構建實驗：

　　

　　原理：細胞與低劑量的藥物長期接觸，引起細胞本身藥物化學過程的改變，細胞膜上出現(xiàn)Pgp糖蛋白，使細胞逐漸對藥物耐受，隨著藥物濃度的遞增，其耐受程度逐漸加強。

　　

　　實驗材料及試劑

　　

　　培養(yǎng)瓶、CO2培養(yǎng)箱、酒精燈、移液槍等；血清培養(yǎng)液、PBS、相應作用的藥物等。

　　

　　實驗內容

　　

　　大劑量間隙作用：對數(shù)生長期的細胞接種于培養(yǎng)瓶中，生長至70%～80%匯合時，將處于對數(shù)生長期的腫瘤細胞置于含有濃度的藥物濃度的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液，PBS清洗2遍，更換不含藥物培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)，待細胞恢復生長，培養(yǎng)一段時間后更換不含藥物的RPMI-1640（DMEM）胎牛血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。待細胞穩(wěn)定生長、進入對數(shù)生長期后，傳代兩次，再將篩選出的細胞在濃度的藥物濃度培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)依這樣不斷改變作用時間，共經過1h、2h、3h、6h、12h、24h、36h、48h、60h、72h共10個作用時間段，約8個月的培養(yǎng)，終使得細胞能夠在一定濃度的藥物的培養(yǎng)液中持續(xù)穩(wěn)定生長并傳代，然后脫藥培養(yǎng)1個月在檢測細胞的生物特性及耐藥指標。

　　

　　濃度梯度遞增間隙作用：采用藥物濃度遞增培養(yǎng)法沖擊誘導，對數(shù)生長期的細胞接種于培養(yǎng)瓶中，細胞處于60～70%濃度對數(shù)期生長時，加入起始濃度為低濃度的藥物作用24h，棄去培養(yǎng)液，PBS清洗2遍，更換不含藥物培養(yǎng)基，細胞恢復生長后，消化傳代復以低濃度作用細胞24h，待細胞增殖至正常形態(tài)后，重復上述藥物沖擊，每種濃度沖擊8次。待細胞在此濃度穩(wěn)定生長后，提高藥物濃度繼續(xù)培養(yǎng)，藥物依次遞增濃度加藥。藥物誘導歷時大約9個月，直到細胞能夠在濃度的藥物中穩(wěn)定生長。