蛋白質(zhì)印記（Western Blot）又稱免疫印跡（immunoblotting），是通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細(xì)胞或生物組織樣品進(jìn)行著色，并且通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中的表達(dá)情況的信息。由于western blot具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性，現(xiàn)已成為蛋白分析的一種常規(guī)技術(shù)，常用于鑒定蛋白，并能對蛋白進(jìn)行定性和半定量分析。
　　
　　技術(shù)優(yōu)勢
　　
　　高分辨率的電泳技術(shù)：聚丙烯酰胺凝膠（polyacrylamidegel，PAGE）把分子篩作用和電荷效應(yīng)結(jié)合在同一方法中，達(dá)到更高的靈敏度。
　　
　　特異敏感的抗原-抗體反應(yīng)：抗原抗體的結(jié)合實(shí)質(zhì)上是抗原表位與抗體超變區(qū)中抗原結(jié)合點(diǎn)之間的結(jié)合。由于兩者在化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型上呈互補(bǔ)關(guān)系，所以抗原與抗體的結(jié)合具有高度的特異性。
　　
　　1-5ng中等大小的靶蛋白：可檢測到低至1～5ng（低可到10～100pg）中等大小的靶蛋白。
　　
　　Western Blot實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)
　　
　　1、把聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上；
　　
　　a.轉(zhuǎn)移緩沖液洗滌凝膠和硝酸纖維素膜，將硝酸纖維素膜鋪在凝膠上，用5ml移液管在凝膠上來回滾動去除所有的氣泡
　　
　　b.在凝膠/濾膜外再包一張3mm濾紙（預(yù)先用轉(zhuǎn)移緩沖液浸濕），將凝膠夾在中間，保持濕潤和沒有氣泡
　　
　　c.將此濾紙/凝膠/薄膜濾紙按照廠家建議方法放入電泳裝置中，凝膠面向陰極
　　
　　d.將上述裝置放入緩沖液槽中，并灌滿轉(zhuǎn)移緩沖液以淹沒凝膠
　　
　　e.按照廠家所示接通電源開始電泳轉(zhuǎn)移
　　
　　f.轉(zhuǎn)移結(jié)束后，取出薄膜和凝膠，棄去凝膠
　　
　　2、將薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量標(biāo)準(zhǔn)顯現(xiàn)時取出，記錄下標(biāo)準(zhǔn)位置；
　　
　　3、用100ml水洗滌纖維素膜，必要時可用脫色緩沖液；
　　
　　4、膜置印跡緩沖液中于37℃保溫1小時；
　　
　　5、室溫下，用PBS-Tween緩沖液洗滌薄膜
　　
　　6、用封口機(jī)將薄膜封入塑料袋中，盡可能不留空氣；
　　
　　7、袋的一角剪一緩沖液的小口，用透析袋夾緊；
　　
　　8、混合：NGS(100微升)，印跡緩沖液中的抗體（2.5-5毫升），加在裝薄膜的袋中，于室溫下?lián)u動2小時（或4℃過夜）；
　　
　　9、用總體積300mlPBS-Tween緩沖液，分4次在一淺盤中洗滌薄膜，每次75ml；
　　
　　10、將連接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升NGS）加在袋內(nèi)，于室溫下?lián)u動1小時；
　　
　　11、按步驟9洗滌；
　　
　　12、加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升NGS），于室溫下?lián)u動；
　　
　　13、Western Blot中轉(zhuǎn)移在膜上的蛋白處于變性狀態(tài)，空間結(jié)構(gòu)改變，因此那些識別空間表位的抗體不能用于Western Blot檢測。這種情況可以將表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞或細(xì)胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用酶標(biāo)記親和素進(jìn)行Western Blot。實(shí)驗(yàn)中取膠和膜需帶手套。