免疫沉淀是利用抗體特異性反應(yīng)純化富集目的蛋白的一種方法?？贵w與細(xì)胞裂解液或表達(dá)上清中相應(yīng)的蛋白結(jié)合后，再與蛋白A/G（ProteinA/G）或二抗偶聯(lián)的agarose或Sepharose珠子孵育，通過(guò)離心得到珠子-蛋白A/G或二抗-抗體-目的蛋白復(fù)合物，沉淀經(jīng)過(guò)洗滌后，重懸于電泳上樣緩沖液，煮沸5-10min，在高溫及還原劑的作用下，抗原與抗體解離，離心收集上清，上清中包括抗體、目的蛋白和少量的雜蛋白。
　　
　　免疫沉淀的實(shí)驗(yàn)過(guò)程比較簡(jiǎn)單，一般分為3個(gè)階段；①抗原溶液的制備；②裂解物非特異性本底的預(yù)處理；③免疫復(fù)合物的形成與純化。免疫沉淀的步是制備抗原溶液。任何抗原溶液均可作為免疫沉淀的材料來(lái)源，但免疫沉淀一般采用細(xì)胞或組織制備的裂解物。裂解物的制備可采用多種方法，其中選用溫和的去污劑如非離子去污劑來(lái)裂解細(xì)胞。該方法能溶解細(xì)胞膜，破壞蛋白質(zhì)之間許多微弱的相互作用，釋放出大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)抗原。更重要的是方法十分溫和，不破壞大多數(shù)抗原的結(jié)構(gòu)和酶的活力。如果對(duì)抗原結(jié)構(gòu)的完整或活力要求不嚴(yán)，或者抗原結(jié)合較為緊密，可以采用比較劇烈的條件來(lái)制備裂解物，如在強(qiáng)變性劑的溶液中進(jìn)行煮沸，然后在免疫沉淀前經(jīng)過(guò)稀釋去除變性劑。一旦細(xì)胞裂解液制備好，即可進(jìn)行預(yù)處理。
　　
　　免疫沉淀常見(jiàn)問(wèn)題：
　　
　　1.免疫沉淀實(shí)驗(yàn)應(yīng)如何把握抗體和緩沖液的比例？
　　
　　答：每次沉淀實(shí)驗(yàn)之前，考慮抗體/緩沖液的比例十分重要。抗體過(guò)少就不能檢出抗原，過(guò)多則就不能沉降在beads上，殘存在上清；緩沖劑太少則不能溶解抗原，過(guò)多則抗原被稀釋。具體比例視具體情況而定。
　　
　　2.用于一般免染的抗體是否都可以用作免疫沉淀實(shí)驗(yàn)？
　　
　　答：抗體的性質(zhì)對(duì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)影響很大。抗體不同，和抗原以及ProteinG或ProteinA的結(jié)合能力也就不同。所以一般免染能結(jié)合的抗體未必能用于IP反應(yīng)。一般來(lái)說(shuō)，多抗是沉淀反應(yīng)的選擇。另外，純化的單抗、腹水和雜交瘤上清液也可用于免疫沉淀。
　　
　　3.免疫沉淀應(yīng)該如何配制細(xì)胞裂解液？
　　
　　答：適當(dāng)?shù)募?xì)胞裂解液的選擇取決于所要研究蛋白的特性。TritonX-100,NP40是非離子界面活性劑，作用溫和;DOC（sodiumde-oxycholate），SDS是離子性的強(qiáng)活性劑。所以裂解液的配制時(shí)所用去污劑的種類(lèi)和濃度以及鹽濃度等條件需實(shí)驗(yàn)者進(jìn)行優(yōu)化。注意如果忘記加TritonX-100，只加DOC或SDS，可能使抗體*失去活性。
　　
　　4.為什么溶解抗原的緩沖液中要加入一定量的蛋白酶抑制劑？
　　
　　答：從活性細(xì)胞裂解出來(lái)的樣品中，往往含有一定量的蛋白酶。為防止預(yù)檢測(cè)蛋白的分解，修飾，溶解抗原的緩沖液必須加蛋白每抑制劑，并且在低溫下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
　　
　　5.溶解抗原的緩沖液的配制需要注意什么？
　　
　　答：多數(shù)的抗原是細(xì)胞構(gòu)成的蛋白，特別是骨架蛋白，緩沖液必須要使其溶解。為此，必須使用含有強(qiáng)表面活性劑的緩沖液，盡管它有可能影響一部分抗原抗體的結(jié)合。另一面，如用弱表面活性劑溶解細(xì)胞，就不能充分溶解細(xì)胞蛋白。即便溶解也產(chǎn)生與其它的蛋白結(jié)合的結(jié)果，抗原決定族被封閉，影響與抗體的結(jié)合。